中华人民共和国国家标准

Rules for tobacco seed（blue mold）quarantine

（国家技术监督局1996年4月17日发布，1997年1月1日实施）

１.主题内容与适用范围

　　本标准规定了烟草种子检疫对象、程序和方法。

　　本标准适用于各种入境烟草种子的检疫。

2.术语

  2.1 检疫：为预防危险性烟草病虫害传播蔓延采取的一种措施。

  ２.2 烟草霜霉病 tobacco blue mold

　　Peronspora tabacina Adam和Peronspora nicotianae Speg，异名Peronspora hyosymi f.sp tabacina 又称蓝霉病，是烟草上一种毁灭性病害。现已蔓延至欧洲、美洲、澳洲，目前我国尚无该病发生，因此做为对外检疫对象。

3.检疫程序

  3.1取样

　　对一批种子总件数按比例抽查取样。在取样时，按对角线五点、棋盘式或分层取样，每点取样10～200g（对旅客携带和国际邮包邮寄的少量烟草种子，取样多少视具体情况而定）。取样要尽量做到有代表性，将取的各点均匀抽取平均样品。

　　3.2孢子囊和孢子梗检疫

　　3.2.1检验方法：洗涤检验法。

　　3.2.2原理：利用振荡的方法，使粘附在种子上的分生孢子和分生孢子梗分散到水中。

　　3.2.3仪器设备：离心机、显微镜、载玻片、三角瓶。

　　3.2.4试剂：蒸馏水。

　　3.2.５步骤

　　取烟种5g，放入三角瓶中，加一定量蒸馏水浸泡0.5h后 ，再加蒸馏水剧烈振荡5min（也可放在振荡器上振荡）。将洗液注入离心管，以1000r/min的速度离心5min，倾去大部分上清液，每个离心管再加入少量蒸馏水，使沉淀重新悬浮，取悬浮液制片，用400～500倍显微镜检查，每个载玻片查10个视野（见图1），每个样品检查5～10个载玻片，检查有无树枝状孢子囊梗和对生的孢子囊，孢子囊大约（13～18）μm×16μm×29μm。

　　烟草霜霉病菌的分生孢子梗和分生孢子切片，见图2。

　　３.3卵孢子检验

　　3.3.1检验方法：乳酚油透明法。

　　3.3.2 原理：乳酚油加苯胺蓝是真菌标准的浮载剂。苯胺蓝是碱性染料，可染真菌的原生质，而不染细胞壁，因此可以分辨清楚很难看清的真菌孢子。

　  3.3.3 仪器设备：显微镜、烧杯、电炉、水浴锅。

　　3.3.4 试剂：苯胺蓝、苯酚、甘油、乳酚油、蒸馏水。

　　3.3.5 步骤

　　取混合样品烟草种子5g，置于烧杯中用乳酚油煮沸15~30min，煮至烟草种子透明，但尚不至于消解为止，加苯胺蓝（棉蓝）染色后用乳酚油作浮载剂，然后镜检。每个样品查20个载玻片[乳酚油的配方：苯酚结晶（水浴加热溶化）20mL，甘油40mL，蒸馏水2mL]。

    3.3.6 检验结果的统计

　　统计孢子数量时，用血球计数器，观察80个小格，用其平均数×4000000，就是每毫升悬浮液孢子的数量。

　　3.4　种子检验

　　3.4.1 检验方法：萌芽检验。

　　3.4.2 仪器设备及试剂：灭菌锅、温箱、培养皿、滤纸、次氯酸钠、无菌水。

　　3.4.3步骤

　　取混合样品种子100粒，重复4次。取直径10cm的无菌柏氏培养皿或塑料培养皿4个，每个培养皿放入三层吸足无菌水的吸水纸，将100粒种子均匀排列在吸足水的纸上，盖上培养皿，保持湿度。然后放入15~20℃温箱内培养，经4~7d观察幼苗上是否有烟草霜霉病菌浸染的迹象。若检查种子内部是否有病菌时，则将种子浸入1%次氯酸钠溶液10min，然后置于无菌滤纸上，培养检查。

　　3.4.4 检查结果的统计

　　单皿发病率和平均发病率按式（1）、（2）计算：

　　3.5　分离培养检验

　　3.5.1 检验方法:琼脂培养检验。

　　3.5.2步骤

　　用适于植物水培的营养盐类2.5g，琼脂14g，蒸馏水1000ML。用300ML的大口三角瓶，每瓶盛培养基80mL，用棉塞塞好，消毒后将培养基做成斜面。培养基凝固后，用表面消毒过的种子，在培养基斜面上每瓶加0.01g置于15~20℃下，种子发芽后，观察幼苗是否有烟草霜霉病菌浸染的迹象。

　　3.5.3 结果统计

　　统计感染霜霉病的百分比，统计方法同3.4.4。

　　3.6 隔离试种

　　3.6.1 报检

　　引种入境之前，引种人应持引种审批单，出口国的检疫证书，贸易合同，向入境的口岸植检机关报检（包括非正规渠道来的种子）。

　　3.6.2供检材料登记：供检材料由引种人（单位）送到隔离检疫圃，交检疫收件人登记。

　　3.6.3 初检：由检疫人员在初检室对送检材料进行初步检查。

　　3.6.4 检疫圃试种：初检合格，可以进入检疫圃的供检材料，在检疫温室用消毒过的土和盆进行育苗盆栽。

　　3.6.5 隔离试种结果评定

　　在温室内对供试材料在生长期进行检查，对检查和检测情况进行详细登记，根据检测情况作出评定。

　　4.1 入境的烟草种子经检疫未发现被检对象则认为合格。

　　4.1.1 发放检疫放行通知单位[附录A（补充件）]

  　以检疫后认为合格的签发检疫放行通知单，或在货运单上加盖检疫放行章。经严格包装，由专人送中国烟草总公司青州烟草研究所隔离试种检疫。

　　4.1.2国内试种

  　经隔离试种后未检出被检对象的，交送检人（单位）在国内试种。

　　4.2 检疫不合格：经检疫发现有检疫对象者认为不合格。

　　4.2 .1签发检疫处理通知单[附录B（补充件）]

　　检疫不合格,发现被检对象应作以下处理并签发检疫处理通知单。

　　4.2.2销毁：被检烟种若发现有检疫对象,而且在抽检烟种中1%的比例内有检疫对象,则应在检疫地原地销毁。

　　4.2.3 退回原地

　　被检烟种中有检疫对象,有以下情况可退回原地:材料较有研究应用价值,抽查烟种检疫对象不超过1%。

　　4.2.4处理后隔离试种

　　对少量引进有价值材料可用热处理,处理后在检疫温室试种。

　　干热处理方法:干热消毒，事先将种子进行60℃，2~3h的通风，使种子充分干燥，种子薄摊成2cm以内厚度，用于热消毒器70℃干热处理2h以上。

　　处理后的种子在检疫温室用无菌土、盆试种，检验有无检疫对象。将繁殖后的种子（应是无菌的）交检人（单位），可在国内试种。

5. 发放检疫证书

　　入境烟草种子没有发现检疫对象时，签发植物检疫证书[附录C（补充件）]；经检疫不符合贸易合同规定时，签发检验证书[附录D（补充件）]，说明情况作为对外索赔证件，并制备保存该被检烟种和检疫对象的标本，作为索赔依据。

    包括受检日期、货批号、数量及重量。

    检疫结果： 

    处理意见：

                检疫员：        检疫单位：

  附加说明：

  本标准由国家烟草专卖局提出。

  本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。

  本标准由中国烟草总公司青州烟草研究所负责起草。

  本标准主要起草人：佟道儒、石金开、蒋予恩、艾树理、刘洪祥。